Modiwl Darnio DNA TIANSeq

Ar hyn o bryd, mae technoleg dilyniannu trwybwn uchel wedi'i seilio'n bennaf ar dechnoleg dilyniannu cenhedlaeth nesaf. Gan fod hyd darllen technoleg dilyniannu’r genhedlaeth nesaf yn gyfyngedig, rhaid i ni rannu’r dilyniant hyd llawn yn llyfrgelloedd darn bach i ddilyniant. Yn ôl anghenion gwahanol arbrofion dilyniannu, rydym fel arfer yn dewis dilyniannu un pen neu ddilyniant dau ben. Ar hyn o bryd mae darnau DNA llyfrgell ddilyniant y genhedlaeth nesaf yn cael eu dosbarthu'n gyffredinol rhwng 200-800 bp.

a) Mae ansawdd DNA yn wael ac mae'n cynnwys atalyddion. Defnyddiwch samplau DNA o ansawdd uchel i osgoi atal gweithgaredd ensymau.

b) Mae maint y sampl DNA yn annigonol wrth ddefnyddio dull di-PCR i adeiladu llyfrgell DNA. Pan fydd mewnbwn y DNA darniog yn fwy na 50 ng, gellir cyflawni llif gwaith di-PCR yn ddetholus yn ystod y broses adeiladu llyfrgell. Os yw rhif copi y llyfrgell yn rhy isel i gael ei ddilyniannu'n uniongyrchol, gellir ymhelaethu ar y llyfrgell DNA gan PCR ar ôl ligation yr addasydd.

c) Mae halogiad RNA yn arwain at feintioli DNA cychwynnol anghywir Gall halogiad RNA fodoli yn y broses buro o DNA genomig, a allai arwain at feintioli DNA anghywir a llwytho DNA annigonol wrth adeiladu llyfrgell. Gellir tynnu RNA trwy drin ag RNase.

A-1

a) Mae darnau bach (60 bp-120 bp) yn ymddangos Fel rheol mae darnau bach yn ddarnau addasyddion neu'n dimers a ffurfiwyd gan addaswyr. Gall puro gyda gleiniau magnetig Agencourt AMPure XP gael gwared ar y darnau addasydd hyn yn effeithiol a sicrhau ansawdd dilyniant.

b) Mae darnau mawr yn ymddangos yn y llyfrgell ar ôl ymhelaethu PCR Bydd maint y darn DNA llyfrgell yn cynyddu 120 bp ar ôl i'r addasydd gael ei glymu. Os bydd y darn DNA yn cynyddu mwy na 120 bp ar ôl ligation yr addasydd, gallai gael ei achosi gan ymhelaethiad darn annormal o ymhelaethiad PCR gormodol. Gall lleihau nifer y cylchoedd PCR atal y sefyllfa.

c) Maint annormal y darnau DNA llyfrgell ar ôl ligation addasydd Hyd yr addasydd yn y pecyn hwn yw 60 bp. Pan fydd dau ben y darn yn cael eu clymu i'r addaswyr, dim ond 120 bp y bydd y hyd yn cynyddu. Wrth ddefnyddio addasydd heblaw'r un a ddarperir gan y pecyn hwn, cysylltwch â'r cyflenwr i ddarparu gwybodaeth berthnasol fel hyd addasydd. Sicrhewch fod llif gwaith a gweithrediad yr arbrawf yn dilyn y camau a ddisgrifir yn y llawlyfr.

ch) Maint darn DNA annormal cyn ligation yr addasydd Gall y rheswm dros y broblem hon gael ei achosi gan amodau ymateb anghywir yn ystod darnio DNA. Dylid defnyddio gwahanol amseroedd ymateb ar gyfer gwahanol fewnbwn DNA. Os yw'r mewnbwn DNA yn fwy na 10 ng, rydym yn argymell dewis yr amser ymateb o 12 munud fel yr amser cychwyn ar gyfer optimeiddio, ac mae maint y darn a gynhyrchir ar yr adeg hon yn bennaf yn yr ystod o 300-500 bp. Gall defnyddwyr gynyddu neu leihau hyd y darnau DNA am 2-4 munud yn unol â'u gofynion eu hunain i wneud y gorau o'r darnau DNA gyda'r maint gofynnol.

A-2

a) Nid yw'r amser darnio wedi'i optimeiddio Os yw'r DNA darniog yn rhy fach neu'n rhy fawr, cyfeiriwch at y Canllawiau ar gyfer Dewis Amser Darnio a ddarperir yn y cyfarwyddyd i bennu'r amser ymateb, a defnyddio'r pwynt amser hwn fel rheolydd, gan sefydlu a hefyd system adweithio i ymestyn neu fyrhau 3 munud i wneud addasiad mwy cywir ar amser darnio.

A-3

Dosbarthiad maint annormal o DNA ar ôl triniaeth darnio

a) Dull dadmer anghywir o ymweithredydd darnio, neu nid yw'r adweithydd wedi'i gymysgu'n llwyr ar ôl dadmer. Toddi'r adweithydd Cymysgedd Ensym Darnio 5 × ar rew. Ar ôl ei ddadmer, cymysgwch yr adweithydd yn gyfartal trwy fflicio gwaelod y tiwb yn ysgafn. Peidiwch â fortecsio'r ymweithredydd!

b) Mae'r sampl mewnbwn DNA yn cynnwys EDTA neu lygryddion eraill Mae disbyddu ïonau halen ac asiantau chelating yn y cam puro DNA yn arbennig o bwysig ar gyfer llwyddiant yr arbrawf. Os yw DNA yn cael ei doddi mewn 1 × TE, defnyddiwch y dull a ddarperir yn y cyfarwyddyd i berfformio darnio. Os yw crynodiad EDTA yn yr hydoddiant yn ansicr, argymhellir puro'r DNA a'i doddi mewn dŵr wedi'i ddad-ddyneiddio ar gyfer adwaith dilynol.

c) Meintioli cychwynnol cychwynnol anghywir Mae gan faint y DNA tameidiog gysylltiad agos â faint o fewnbwn DNA. Cyn triniaeth darnio, mae meintioli DNA yn gywir gan ddefnyddio Qubit, Picogreen a dulliau eraill yn hanfodol i bennu union faint o DNA yn y system adweithio.

 d) Nid yw paratoi'r system adweithio yn dilyn y cyfarwyddyd Rhaid paratoi'r system adweithio dameidiog ar rew yn unol â'r cyfarwyddiadau. Er mwyn sicrhau'r effaith orau, dylid gosod yr holl gydrannau adweithio ar rew a dylid paratoi'r system adweithio ar ôl iddo oeri yn llwyr. Ar ôl i'r paratoad gael ei gwblhau, ffliciwch neu bibed i gymysgu'n drylwyr. Peidiwch â fortecs!

1. Bydd dull cymysgu amhriodol (fortecs, osciliad treisgar, ac ati) yn achosi dosbarthiad annormal o ddarnau llyfrgell (fel y dangosir yn y ffigur canlynol), gan effeithio felly ar ansawdd y llyfrgell. Felly, wrth baratoi datrysiad adwaith Fragmentation Mix, os gwelwch yn dda pibedwch yn ysgafn i fyny ac i lawr i gymysgu, neu defnyddiwch flaenau eich bysedd i fflicio a chymysgu'n gyfartal. Byddwch yn ofalus i beidio â chymysgu â fortecs.

2. Rhaid defnyddio DNA purdeb uchel ar gyfer adeiladu llyfrgelloedd

■ Uniondeb DNA da: Mae'r band electrofforesis yn fwy na 30 kb, heb gynffonio

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Rhaid i swm mewnbwn DNA fod yn gywir Awgrymir defnyddio dulliau Qubit a PicoGreen i feintioli DNA, yn hytrach na Nanodrop.

4. Rhaid penderfynu ar gynnwys EDTA mewn datrysiad DNA Mae gan EDTA ddylanwad mawr ar yr adwaith darnio. Os yw cynnwys EDTA yn uchel, mae angen puro DNA cyn y prawf dilynol.

5. Rhaid paratoi'r datrysiad adweithio darnio ar rew Mae'r broses ddarnio yn sensitif i dymheredd ac amser adweithio (yn enwedig ar ôl ychwanegu teclyn gwella). Er mwyn sicrhau cywirdeb yr amser ymateb, paratowch y system adweithio ar rew.

6. Rhaid i'r amser ymateb darnio fod yn gywir Bydd amser ymateb y cam darnio yn effeithio'n uniongyrchol ar faint y cynhyrchion darnio, gan effeithio felly ar ddosbarthiad maint y darnau DNA yn y llyfrgell.

1. Pa fath o sampl sy'n berthnasol i'r pecyn hwn?

Gall y math sampl cymwys o'r pecyn hwn fod yn RNA llwyr neu'n mRNA wedi'i buro gyda chywirdeb RNA da. Os defnyddir cyfanswm RNA i adeiladu'r llyfrgell, argymhellir defnyddio'r pecyn disbyddu rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) i gael gwared ar rRNA yn gyntaf.

2. A ellir defnyddio samplau FFPE i adeiladu llyfrgell gyda'r pecyn hwn?

Bydd yr mRNA mewn samplau FFPE yn cael ei ddiraddio i raddau, gydag uniondeb cymharol wael. Wrth ddefnyddio'r pecyn hwn ar gyfer adeiladu'r llyfrgell, argymhellir gwneud y gorau o'r amser darnio (cwtogi'r amser darnio neu beidio â pherfformio darnio).

3. Gan ddefnyddio'r cam dewis maint a ddarperir yn y llawlyfr cynnyrch, beth allai beri i'r segment a fewnosodwyd ymddangos yn wyriad bach?

Rhaid dewis maint yn unol yn llwyr â'r cam dewis maint yn y llawlyfr cynnyrch hwn. Os oes gwyriad, efallai mai'r rheswm yw nad yw'r gleiniau magnetig yn gytbwys i dymheredd yr ystafell neu nad ydynt wedi'u cymysgu'n llawn, nid yw'r pibed yn gywir neu mae'r hylif yn aros yn y domen. Argymhellir defnyddio'r awgrymiadau gyda arsugniad isel ar gyfer yr arbrawf.

4. Dewis addaswyr wrth adeiladu llyfrgelloedd

Nid yw'r pecyn adeiladu llyfrgell yn cynnwys ymweithredydd addasydd, ac argymhellir defnyddio'r pecyn hwn ynghyd ag Addasydd Mynegai Sengl TIANSeq (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC y llyfrgell

Canfod meintiol y llyfrgell: Defnyddir Qubit a qPCR i bennu crynodiad màs a chrynodiad molar y llyfrgell yn y drefn honno. Mae'r llawdriniaeth yn hollol unol â'r llawlyfr cynnyrch. Yn gyffredinol, bydd crynodiad y llyfrgell yn cwrdd â gofynion dilyniant NGS. Canfod ystod dosbarthu llyfrgelloedd: Defnyddio Agilent 2100 Bioanalyzer i ganfod ystod dosbarthu'r llyfrgell.

6. Dewis rhif cylch ymhelaethu

Yn ôl y cyfarwyddiadau, nifer y cylchoedd PCR yw 6-12, a dylid dewis nifer y cylchoedd PCR sydd eu hangen yn ôl y mewnbwn sampl. Mewn llyfrgelloedd cynnyrch uchel, mae gor-ymhelaethu fel arfer yn digwydd ar raddau amrywiol, a amlygir gan uchafbwynt ychydig yn fwy ar ôl uchafbwynt yr ystod darged wrth ganfod Agilent 2100 Bioanalyzer, neu mae'r crynodiad a ganfyddir o Qubit yn is na qPCR. Mae ymhelaethu ysgafn yn ffenomen arferol, nad yw'n effeithio ar ddilyniant llyfrgelloedd a dadansoddi data wedi hynny.

7. Mae pigau yn ymddangos ym mhroffil canfod Agilent 2100 Bioanalyzer

Mae ymddangosiad pigau wrth ganfod Bioanalyzer Agilent 2100 oherwydd darnio anwastad samplau, lle bydd mwy o ddarnau o faint penodol, a bydd hyn yn dod yn fwy amlwg ar ôl cyfoethogi PCR. Yn yr achos hwn, awgrymir peidio â pherfformio'r dewis maint, hy gosod yr amod darnio i 94 ° C ar gyfer deori 15 munud, lle mae dosbarthiad y darn yn fach ac yn ddwys, a gellir gwella'r homogenedd.