Cymysgedd PCR 2 × GC-gyfoethog

Templed A-1

■ Mae'r templed yn cynnwys amhureddau protein neu atalyddion Taq, ac ati. ——Creu templed DNA, cael gwared ar amhureddau protein neu dynnu DNA templed gyda chitiau puro.

■ Nid yw dadnatureiddio templed yn gyflawn —— Cynyddu tymheredd dadnatureiddio yn briodol ac ymestyn amser dadnatureiddio.

Diraddio templed —— Ail-baratoi'r templed.

Primer A-2

■ Ansawdd gwael primers —— Ail-syntheseiddio'r primer.

■ Diraddio primer ——Gwelwch y preimio crynodiad uchel yn gyfaint fach i'w cadw. Osgoi rhewi a dadmer lluosog neu cryopreserved tymor hir 4 ° C.

■ Dyluniad primer primers (ee hyd primer ddim yn ddigonol, dimer wedi'i ffurfio rhwng primers, ac ati) - Ailgynllunio primers (osgoi ffurfio dimer primer a strwythur eilaidd)

A-3 Mg²⁺crynodiad

■ Mg²⁺ mae'r crynodiad yn rhy isel —— Cynyddu Mg yn briodol²⁺ crynodiad: Optimeiddio'r Mg²⁺ crynodiad gan gyfres o adweithiau o 1 mM i 3 mM gydag egwyl o 0.5 mM i bennu'r Mg gorau posibl²⁺ crynodiad ar gyfer pob templed a primer.

A-4 Tymheredd Annealing

■ Mae'r tymheredd anelio uchel yn effeithio ar rwymo primer a thempled. ——Gwelwch y tymheredd anelio a gwneud y gorau o'r cyflwr gyda graddiant o 2 ° C.

A-5 Amser estyn

■ Amser estyn byr —— Cynyddu'r amser estyn.

Ffenomena: Mae samplau negyddol hefyd yn dangos y bandiau dilyniant targed.

A-1 Halogiad PCR

■ Traws-halogi dilyniant targed neu gynhyrchion ymhelaethu —— Yn anffodus i beidio â phibetio'r sampl sy'n cynnwys dilyniant targed yn y sampl negyddol na'u gollwng allan o'r tiwb centrifuge. Dylai'r adweithyddion neu'r offer gael eu hawtoclafio i gael gwared ar asidau niwcleig sy'n bodoli, a dylid pennu bodolaeth halogiad trwy arbrofion rheoli negyddol.

Halogiad ymweithredydd ——Gwelwch yr adweithyddion a'u storio ar dymheredd isel.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ mae'r crynodiad yn rhy isel —— Cynyddu Mg yn briodol²⁺ crynodiad: Optimeiddio'r Mg²⁺ crynodiad gan gyfres o adweithiau o 1 mM i 3 mM gydag egwyl o 0.5 mM i bennu'r Mg gorau posibl²⁺ crynodiad ar gyfer pob templed a primer.

■ Dyluniad primer amhriodol, ac mae gan y dilyniant targed homoleg gyda'r dilyniant nad yw'n darged. —— Ail-ddylunio primers.

Ffenomena: Mae'r bandiau ymhelaethu PCR yn anghyson â'r maint disgwyliedig, naill ai'n fawr neu'n fach, neu weithiau mae bandiau ymhelaethu penodol a bandiau ymhelaethu amhenodol yn digwydd.

Primer A-1

■ Penodoldeb primer gwael

—— Ail-ddylunio primer.

■ Mae'r crynodiad primer yn rhy uchel —— Cynyddu'r tymheredd dadnatureiddio yn raddol ac ymestyn amser dadnatureiddio.

A-2 Mg²⁺ crynodiad

■ Yr Mg²⁺ mae'r crynodiad yn rhy uchel —— Lleihau'r crynodiad Mg2 + yn briodol: Optimeiddio'r Mg²⁺ crynodiad gan gyfres o adweithiau o 1 mM i 3 mM gydag egwyl o 0.5 mM i bennu'r Mg gorau posibl²⁺ crynodiad ar gyfer pob templed a primer.

A-3 Polymeras thermostadwy

■ Swm gormodol o ensymau ——Gwelwch swm ensym yn briodol ar gyfnodau o 0.5 U.

A-4 Tymheredd Annealing

■ Mae'r tymheredd anelio yn rhy isel —— Cynyddu'r tymheredd anelio yn briodol neu fabwysiadu'r dull anelio dau gam

Cylchoedd PCR A-5

■ Gormod o gylchoedd PCR —— Lleihau nifer y cylchoedd PCR.

Primer A-1—— Penodoldeb penodol —— Ail-ddylunio'r primer, newid lleoliad a hyd y paent preimio i wella ei benodolrwydd; neu berfformio PCR nythu.

Templed A-2 DNA

—— Nid yw'r templed yn bur ——Diogelu'r templed neu dynnu DNA gyda chitiau puro.

A-3 Mg²⁺ crynodiad

——Mg²⁺ mae'r crynodiad yn rhy uchel —— Lleihau Mg yn briodol²⁺ crynodiad: Optimeiddio'r Mg²⁺ crynodiad gan gyfres o adweithiau o 1 mM i 3 mM gydag egwyl o 0.5 mM i bennu'r Mg gorau posibl²⁺ crynodiad ar gyfer pob templed a primer.

A-4 dNTP

——Mae crynodiad dNTPs yn rhy uchel ——Gwella crynodiad dNTP yn briodol

A-5 Tymheredd Annealing

——To tymheredd anelio isel —— Cynyddu'r tymheredd anelio yn briodol

Beiciau A-6

——To lawer o feiciau ——Gwella rhif y beic

Y cam cyntaf yw dewis y polymeras priodol. Ni all polymeras Taq rheolaidd brawfddarllen oherwydd diffyg gweithgaredd datgladdu 3'-5 ', a bydd camgymhariad yn lleihau effeithlonrwydd estyn darnau yn fawr. Felly, ni all polymeras Taq rheolaidd ymhelaethu ar ddarnau targed sy'n fwy na 5 kb yn effeithiol. Dylid dewis Taq polymerase gydag addasiad arbennig neu polymeras ffyddlondeb uchel arall i wella effeithlonrwydd estyniad a diwallu anghenion ymhelaethu darn hir. Yn ogystal, mae ymhelaethu ar ddarnau hir hefyd yn gofyn am addasiad cyfatebol o ddyluniad primer, amser dadnatureiddio, amser estyn, pH byffer, ac ati. Fel arfer, gall preimio â 18-24 bp arwain at well cynnyrch. Er mwyn atal difrod templed, dylid lleihau'r amser dadnatureiddio ar 94 ° C i 30 eiliad neu lai y cylch, a dylai'r amser i godi tymheredd i 94 ° C cyn ymhelaethu fod yn llai nag 1 munud. Ar ben hynny, gall gosod tymheredd yr estyniad ar oddeutu 68 ° C a dylunio'r amser estyn yn ôl y gyfradd o 1 kb / min sicrhau ymhelaethiad effeithiol ar ddarnau hir.

Gellir lleihau cyfradd gwallau ymhelaethu PCR trwy ddefnyddio amryw o bolymerasau DNA gyda ffyddlondeb uchel. Ymhlith yr holl bolymerasau DNA Taq a ddarganfuwyd hyd yn hyn, ensym Pfu sydd â'r gyfradd wallau isaf a'r ffyddlondeb uchaf (gweler y tabl ynghlwm). Yn ogystal â dewis ensymau, gall ymchwilwyr leihau cyfradd treiglo PCR ymhellach trwy optimeiddio amodau adweithio, gan gynnwys optimeiddio cyfansoddiad byffer, crynodiad polymeras thermostable a gwneud y gorau o rif beic PCR.