FastKing RT Kit (Gyda gDNase)

Mae RNA A-1 yn cael ei ddiraddio

——Gwella RNA o ansawdd uchel heb unrhyw halogiad. Dylai'r deunydd y mae RNA yn cael ei dynnu ohono fod mor ffres â phosibl i atal diraddiad RNA. Dadansoddwch gyfanrwydd RNA ar gel annaturiol cyn adwaith RT. Ar ôl echdynnu RNA, dylid ei storio mewn fformamid 100%. Os defnyddir atalydd RNase, dylai'r tymheredd gwresogi fod yn <45 ° C, a dylai'r pH fod yn llai nag 8.0, fel arall bydd yr atalydd yn rhyddhau pob RNase wedi'i rwymo. At hynny, dylid ychwanegu atalydd RNase mewn datrysiadau sy'n cynnwys DTT 0.8 0.8 mM.

Mae RNA A-2 yn cynnwys atalyddion adweithiau trawsgrifio cefn

—— Mae atalyddion trawsgrifio gwrthdro yn cynnwys SDS, EDTA, glyserol, sodiwm pyrophosphate, spermidine, formamide, halen guanidine, ac ati. Cymysgwch yr RNA rheoli gyda'r sampl, a chymharwch y cynnyrch â'r adwaith RNA rheoli i wirio a oes atalydd. Golchwch wlybaniaeth RNA gyda 70% (v / v) ethanol i gael gwared ar atalyddion.

A-3 Anelio annigonol o brimynnau a ddefnyddir i syntheseiddio'r llinyn cyntaf o cDNA

—— Penderfynu bod y tymheredd anelio yn addas ar gyfer y paent preimio a ddefnyddir yn yr arbrawf. Ar gyfer hecsamerau ar hap, argymhellir cadw'r tymheredd ar 25 ° C am 10 munud cyn cyrraedd tymheredd yr adwaith. Ar gyfer primers penodol i genynnau (GSP), rhowch gynnig ar GSP eraill, neu newid i oligo (dT) neu hecsamer ar hap.

A-4 Swm bach o RNA cychwynnol

—— Lleihau faint o RNA. Ar gyfer samplau RNA sy'n llai na 50 ng, gellir defnyddio 0.1 μg i 0.5 μg asetyl BSA yn y synthesis cDNA llinyn cyntaf

A-5 Ni fynegir y dilyniant targed yn y meinweoedd a ddadansoddwyd.

——Try meinweoedd eraill.

Mae adwaith PCR A-6 yn methu

—— Ar gyfer RT-PCR dau gam, ni all y templed cDNA yn y cam PCR fod yn fwy na 1/5 o gyfaint yr adwaith.

A-1 Anelio primers a thempledi amhenodol

—— Ni ddylai diwedd 3 'primers gynnwys 2-3 dG na dC. Defnyddiwch primers Gene-benodol yn y synthesis llinyn cyntaf yn lle primers ar hap neu oligo (dT). Defnyddiwch dymheredd anelio uwch yn yr ychydig gylchoedd cyntaf, ac yna tymheredd anelio is. Defnyddiwch polymeras DNA Taq cychwyn poeth ar gyfer PCR i wella penodoldeb yr adwaith.

A-2 Dyluniad gwael primers penodol i genynnau

——Gollwch yr un egwyddorion ar gyfer dylunio primer ymhelaethu.

RNA A-3 wedi'i halogi â DNA genomig

——Treat RNA gyda gradd PCR DNase I. Sefydlu adwaith rheoli heb drawsgrifio cefn i ganfod halogiad DNA.

A-4 Ffurfio pylu primer

——Dylunio primers heb ddilyniannau cyflenwol ar y diwedd 3 '.

A-5 Rhy uchel Mg²⁺ crynodiad

——Gwella Mg²⁺ crynodiad ar gyfer pob templed a chyfuniad primer

A-6 Halogedig â DNA tramor

——Defnyddiwch gynghorion sy'n gwrthsefyll aerosol ac ensymau UDG.

A-1 Mae cynnwys y cynnyrch llinyn cyntaf yn rhy uchel

——Gwelwch swm y cynnyrch llinyn cyntaf yn y cam adweithio PCR confensiynol.

A-2 Swm primer rhy uchel mewn adwaith PCR

——Gwella mewnbwn primer.

A-3 Gormod o feiciau

——Gwella amodau ymateb PCR a lleihau nifer beiciau PCR.

A-4 Tymheredd anelio rhy isel

——Cynyddu tymheredd anelio i atal cychwyn ac estyn amhenodol.

A-5 Ymhelaethiad amhenodol ar ddarnau oligonucleotid a gynhyrchir gan ddiraddiad DNase o DNA ——Gynnwch RNA o ansawdd uchel i atal halogiad DNA.

Mae RT-PCR i wrthdroi trawsgrifio RNA yn cDNA, ac yna defnyddio'r cDNA gwrthdroi wedi'i drawsgrifio fel templed ar gyfer adwaith PCR i ymhelaethu ar y darn targed. Dewiswch naill ai primers ar hap, Oligo dT a phreserau genynnau penodol yn ôl amodau penodol yr arbrawf. Gellir defnyddio'r holl gysefinau uchod ar gyfer mRNA celloedd ewcaryotig byr heb strwythur hairpin.

Primer ar hap: Yn addas ar gyfer RNA hir gyda strwythur hairpin, yn ogystal â phob math o RNA fel rRNA, mRNA, tRNA, ac ati. Fe'u defnyddir yn bennaf ar gyfer adwaith RT-PCR o dempled sengl.

Oligo dT: Yn addas ar gyfer RNA gyda chynffonnau PolyA (nid oes gan RNA procaryotig, Oligo dT rRNA ewcaryotig a tRNA gynffonau PolyA). Oherwydd bod Oligo dT yn rhwym i gynffon PolyA, mae'n ofynnol i ansawdd samplau RNA fod yn uchel, a bydd hyd yn oed ychydig bach o ddiraddiad yn lleihau'n fawr faint o synthesis cDNA hyd llawn.

Primer penodol i genynnau: Yn ategu'r dilyniant templed, sy'n addas ar gyfer sefyllfaoedd lle mae'r dilyniant targed yn hysbys.

Mae dwy ffordd:

1. Dull cyfeirio mewnol: Mewn theori, mae cDNA yn ddarnau DNA o wahanol hyd, felly canlyniad electrofforesis yw ceg y groth. Os yw digonedd RNA yn isel, ni fydd unrhyw gynnyrch yn dangos mewn electrofforesis, ond nid yw hyn yn golygu na fydd PCR yn ymhelaethu ar unrhyw gynnyrch. Yn gyffredinol, gellir defnyddio cyfeiriad mewnol i ganfod cDNA. Os oes canlyniadau i'r cyfeirnod mewnol, gellir gwarantu ansawdd cDNA yn y bôn (mewn rhai achosion, os yw'r darn genyn targed yn rhy hir, efallai y bydd eithriadau).

2. Os oes genyn hysbys wedi'i ymhelaethu gan y templed hwn, gellir ei wirio gan primers y genyn hwn. Nid yw ymhelaethu ar gyfeiriadau mewnol o reidrwydd yn golygu nad oes problem gyda cDNA. Oherwydd bod gan gyfeirnod mewnol ddigonedd uchel mewn cDNA, mae'n hawdd ymhelaethu. Os yw cDNA yn cael ei ddiraddio'n rhannol am amryw resymau, o safbwynt tebygolrwydd, bydd canlyniadau PCR genynnau targed digonedd isel yn cael eu heffeithio'n fawr. Er bod digon o gyfeiriadau mewnol o hyd, mae'n debyg na fydd yr ymhelaethiad yn cael ei effeithio.

Diraddio RNA yn rhannol. Canfod cyfanrwydd a phuro RNA

Gall cynnwys RNA gwahanol rywogaethau fod yn wahanol, ond yn gyffredinol, dylai'r cyfanswm RNA a echdynnwyd gynnwys dau fand 28S a 18S clir mewn electrofforesis gel, a dylai disgleirdeb y band blaenorol fod ddwywaith mor uchel â chynnwys yr olaf. Mae'r band 5S yn nodi bod RNA wedi'i ddiraddio, ac mae ei ddisgleirdeb yn gymesur â graddfa'r diraddiad. Nid yw'r ymhelaethiad llwyddiannus ar gyfeirnod mewnol yn golygu nad oes problem gydag RNA, oherwydd bod y cyfeirnod mewnol yn helaeth, gellir ymhelaethu ar RNA cyn belled nad yw'r diraddiad yn ddifrifol. Yr OD₂₆₀/ OD₂₈₀dylai'r gymhareb RNA pur a fesurir gan sbectroffotomedr fod rhwng 1.9 a 2.1. Bydd ychydig bach o amhuredd protein mewn RNA yn lleihau'r gymhareb. Cyn belled nad yw'r gwerth yn rhy isel, ni fydd RT yn cael ei effeithio. Yr hyn sydd bwysicaf i RT yw uniondeb RNA.

Ni all estyniad y genyn cyfeirio mewnol ond nodi bod RT wedi llwyddo, ond nid yw o reidrwydd yn gysylltiedig ag ansawdd y llinyn cDNA. Oherwydd bod y darnau cyfeirio mewnol yn gyffredinol yn fach o ran maint ac yn uchel eu mynegiant, mae'n haws bod yn llwyddiannus wrth drawsgrifio cefn. Fodd bynnag, mae maint a mynegiant genyn targed yn amrywio o enyn i enyn. Ni ellir barnu ansawdd cDNA trwy gyfeirnod mewnol yn unig yn enwedig ar gyfer y darnau targed sy'n hwy na 2 kb.

Mae gan rai samplau strwythurau eilaidd cymhleth, neu mae ganddynt gynnwys GC cyfoethog, neu maent yn werthfawr gyda digonedd isel. Yn yr achosion hyn, dylid dewis gwrthdroad transcriptase priodol yn ôl maint y darn targed a'r sampl. Ar gyfer templedi RNA sydd â chynnwys GC uchel a strwythur eilaidd cymhleth, mae'n anodd agor y strwythur eilaidd ar dymheredd isel, neu gyda transcriptase gwrthdroi cyffredin. Ar gyfer y templedi hyn, gellir dewis Quant Reverse Transcriptase, gan fod ei berfformiad trawsgrifio cefn yn amlwg yn well na pherfformiad transversease gwrthdro cyfres M-MLV, a all wrthdroi trawsgrifio amrywiol dempledi RNA yn effeithlon a thrawsgrifio RNA yn llinyn cyntaf cDNA i'r graddau mwyaf. Wrth ddefnyddio pecyn gwrthdroi transcriptase cyffredinol, dim ond i bob pwrpas y gall system 20 μl wyrdroi trawsgrifio 1 μg o gyfanswm yr RNA. Rhowch sylw i uchafswm capasiti RT y cit. Os ychwanegir gormod o'r templed, bydd trawsgrifio cefn yn ffafrio'r RNA gyda digonedd uchel. Felly, mae'n well peidio â mynd y tu hwnt i gapasiti mwyaf y system.

A-1 Darganfyddwch a yw RNA wedi'i ddiraddio'n ddifrifol ac a yw RT yn llwyddiannus

Yn gyffredinol, mae'r rheswm dros fethiant ymhelaethu cyfeiriadau mewnol yn aml yn cael ei achosi gan ddiraddiad RNA difrifol. Rheswm posibl arall yw methiant trawsgrifio gwrthdroi. Ni ellir defnyddio cyfeirnod mewnol fel safon i farnu ansawdd llinyn sengl cDNA, ond gellir ei ddefnyddio fel safon i farnu a yw trawsgrifio cefn yn llwyddiannus os nad oes problem o ran ansawdd yr RNA. Y peth pwysicaf yn y broses trawsgrifio cefn yw cynnal tymheredd cyson a system adweithio gyson er mwyn gwella effeithlonrwydd adweithio.

A-2 Darganfyddwch a yw'r primers ar gyfer ymhelaethu genynnau cyfeirio mewnol yn ddibynadwy ac a oes unrhyw broblemau gydag adweithyddion a ddefnyddir mewn PCR.

Ar gyfer meintioli cymharol, rhaid meintioli RNA cyn trawsgrifio cefn, sydd hefyd yn ofynnol mewn llawer o becynnau trawsgrifio cefn, er enghraifft, meintioli mewnbwn yr RNA fel 1 μg. Gan fod y cDNA gwrthdroi wedi'i drawsgrifio yn ddatrysiad cymysg, gan gynnwys RNA, oligo dT, ensym, dNTP, a hyd yn oed ychydig o weddillion DNA, bydd gwyriad yn cael ei achosi, felly mae'n amhosibl meintioli'r cDNA yn gywir. Felly, mae angen meintioli RNA. O ystyried bod effeithlonrwydd trawsgrifio cefn yr un peth ymhlith gwahanol samplau, dylai'r swm o cDNA a gafwyd fod yr un peth, a gall y dadansoddiad meintiol ddangos cymhariaeth lefelau mynegiant gwahanol enynnau yn yr un faint o gyfanswm RNA. Wrth berfformio PCR meintiol fflwroleuedd cymharol, efallai na fydd angen cDNA meintiol ar ôl trawsgrifio cefn oherwydd gellir gweithredu bod y genyn cyfeirio mewnol yn gyfeirnod.

Mae'n gysylltiedig yn bennaf â'r genynnau, ac nid yw trawsgrifio gwrthdroi darn hir yn ymarferol i'r mwyafrif o enynnau. Yn gyntaf, mae effeithlonrwydd trawsgrifio cefn yn llawer is nag effeithlonrwydd PCR. Yn ail, mae rhanbarth cyfoethog GC a strwythur eilaidd llawer o enynnau yn cyfyngu trawsgrifio cefn a PCR. Yn olaf, mae'n anodd gwarantu ffyddlondeb ac effeithlonrwydd ymhelaethu PCR ar yr un pryd. Yn y broses o drawsgrifio cefn, ni all unrhyw un warantu cael darn hir ar gyfer genynnau copi isel, yn enwedig gan ddefnyddio oligo dT. Fel ar gyfer 5 'UTR gyda mwy o GC, mae'n anoddach fyth. Felly, mae'n dal i fod yn ddull rhesymol i wyrdroi trawsgrifiad â primers ar hap, dod o hyd i'r safleoedd holltiad naturiol yn y darn targed, ymhelaethu fesul segmentau, ac yna perfformio'r treuliad a'r ligiad cyfyngu. Yn gyffredinol, mae'n anodd ymhelaethu ar ddarnau sy'n fwy na 2 kb yn uniongyrchol, ond nid yw bob amser yn amhosibl cael: 1.First of all, gwarantu cyfanrwydd RNA / mRNA, ac mae'n well gan echdynnu TRIZOL. Gellir defnyddio pecyn 2.M-MLV RT-PCR yn uniongyrchol. Ymestyn amser anelio a chynyddu nifer y beiciau yn y broses ymhelaethu yn iawn. Fel arall, gellir cymhwyso PCR wedi'i nythu, neu gynnal un neu ddau o ymatebion yn gyntaf gydag amser dadnatureiddio ac estyn wedi'i ymestyn yn briodol cyn ymhelaethu PCR arferol, a allai helpu i ymestyn darnau. Rhowch sylw i ffyddlondeb y polymeras. Gellir defnyddio 3.Long Taq mewn PCR i gael canlyniadau delfrydol. 4. Ar gyfer cais mynegiant protein, dylid cymhwyso polymeras ffyddlondeb uchel.

Mae TIANGEN yn cynnig dau fath o gefn transcriptase: Quant / King RTase a TIANScript M-MLV. Y prif wahaniaeth rhyngddynt yw swm mewnbwn y templedi. Mae Quant yn drawsysgrifiad gwrthdro unigryw, sy'n wahanol i'r M-MLV a ddefnyddir yn gyffredin sy'n deillio o firws lewcemia Moloney murine. Mae Quant yn drawsysgrifiad gwrthdroi effeithlonrwydd uchel newydd a fynegir yn ailgyfunol gan beirianneg Escherichia coli. Mae Quant yn addas ar gyfer ymhelaethu 50 ng-2 μg o RNA gyda gweithgaredd trawsgrifio cefn uchel a chynnyrch uchel. O'i gymharu â MMLV neu AMV cyffredin, nodwedd fwyaf Quant yw bod ganddo gysylltiad cryf iawn â thempledi RNA ac y gall wyrdroi templedi cymhleth trawsgrifio heb ddadnatureiddio tymheredd uchel. Ar gyfer templedi â chynnwys GC uwch, mae'r effeithlonrwydd gwrthdroi yn uwch. Fodd bynnag, mae gan y gwrthdroad transcriptase hwn weithgaredd RNase H, a allai effeithio ar hyd y cynnyrch cDNA (sy'n addas ar gyfer templedi <4.5 kb). Ar gyfer trawsgrifio cefn confensiynol, argymhellir TIANScript MMLV reverse transcriptase. Mae'r RTase hwn yn ensym wedi'i addasu gyda gweithgaredd RNase H gwan iawn, sy'n addas ar gyfer synthesis cDNA hir (> 5 kb).

Mae trawsgrifio cefn un cam ac ymhelaethiad PCR yn cael eu cwblhau yn yr un tiwb heb agor gorchudd y tiwb rhwng synthesis cDNA ac ymhelaethu, sy'n ddefnyddiol i leihau halogiad. Gan fod yr holl samplau cDNA a gafwyd yn cael eu defnyddio ar gyfer ymhelaethu, mae'r sensitifrwydd yn uwch, gydag isafswm o 0.01 pg o gyfanswm yr RNA. Ar gyfer RTPCR un cam llwyddiannus, defnyddir primers penodol i genynnau yn gyffredinol i gychwyn synthesis cDNA. Gwneir y dull dau gam, sef trawsgrifio cefn ac ymhelaethu PCR mewn dau gam. Yn gyntaf, mae trawsgrifio cefn yn cael ei wneud o dempled RNA i gael cDNA, ac mae'r cDNA a gafwyd yn destun un neu fwy o ymatebion PCR gwahanol. Gall y dull dau gam ddefnyddio oligo (dT) neu primers ar hap i arwain synthesis y llinyn cyntaf o cDNA, a gall wrthdroi trawsgrifio'r holl wybodaeth mRNA o sampl benodol.