Pecyn PCR Gwaed Uniongyrchol

Ymhelaethiad cyflym o'r genyn targed gan ddefnyddio gwaed yn uniongyrchol fel templed heb echdynnu.

Mae'r pecyn hwn yn mabwysiadu polymeras DNA gwrth-atalydd wedi'i beiriannu'n enetig i ymhelaethu ar enynnau un copi yn y genom dynol yn effeithlon. Mae'r system glustogi sydd wedi'i optimeiddio'n dda yn y pecyn hwn yn helpu'r polymeras i wrthsefyll ataliad atalyddion PCR yn gryf, felly gall ymhelaethu ar DNA yn uniongyrchol gan ddefnyddio gwaed a chelloedd diwylliedig fel templedi. Mae'r cynnyrch hwn yn hawdd i'w weithredu ac nid oes angen camau cymhleth fel puro DNA neu ragflaenu sampl.
Darperir y pecyn hwn fel 2 × MasterMix, a gellir cyflawni'r adwaith trwy ychwanegu'r templed gwaed a'r primers canfod cyfatebol yn unig. Gellir ei gymhwyso ar gelloedd diwylliedig mamaliaid fel bodau dynol, llygod, moch, gwartheg a rhywogaethau eraill, yn ogystal â gwaed cyfan ffres neu 4 ℃ cryopreserved, gwrthgeulydd (EDTA, sitrad, heparin), ceuladau gwaed hylifedig a smotiau gwaed sych wedi'u storio ar gardiau masnachol Whatman 903 a FTA Elute.

Cath. Na	Maint Pacio
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Anfon e-bost atom

Manylion y Cynnyrch

Enghraifft Arbrofol

Cwestiynau Cyffredin

Tagiau Cynnyrch

Nodweddion

■ Syml a chyflym: gellir ymhelaethu PCR yn uniongyrchol gan ddefnyddio gwaed fel templed, heb yr angen am gamau diflas paratoi sampl ac echdynnu DNA.
■ Purdeb uchel: Gall y sgip o gamau cyn-driniaeth ac echdynnu DNA helpu i osgoi croeshalogi samplau.
■ Trwybwn uchel: Gellir adnabod PCR ar gyfer samplau ar raddfa fawr trwy gyfuno'r cit â phlatiau PCR 96/384-dda.
■ Cyffredinolrwydd cryf: Gall y pecyn hwn ymhelaethu ar ddarnau neu ddarnau GC uchel gyda strwythur eilaidd cymhleth, a gall hyd yr ymhelaethu fod hyd at 5 kb.
■ Gwrthiant straen cryf: Gellir defnyddio'r pecyn hwn ar gyfer amrywiol rywogaethau a samplau gwaed sy'n cael eu cadw mewn gwahanol ffyrdd.

Ceisiadau

Mae cynhyrchion PCR y pecyn hwn yn cynnwys “A” ar y pen 3’, y gellir ei ddefnyddio’n uniongyrchol ar gyfer clonio fector TA. Gellir defnyddio'r pecyn hwn ar gyfer ymhelaethu ar ddarnau DNA genomig, dadansoddiad genetig trwybwn uchel a dadansoddiad genoteipio (megis canfod genynnau).

Gellir addasu'r holl gynhyrchion ar gyfer ODM / OEM. Am fanylion,cliciwch Gwasanaeth Customized (ODM / OEM)

Blaenorol: TIANcombi DNA Lyse & Det PCR Kit

Nesaf: Pecyn PCR Uniongyrchol Meinwe Llygoden

	Gan ddefnyddio gwrthgeulyddiad EDTA dynol fel templed, cafodd 4 genyn â chynnwys GC gwahanol eu chwyddo gan Blood Direct PCR Kit. Roedd y system adweithio PCR yn 20 μl, a defnyddiwyd gwaed 1 μl fel templed. M: Marciwr II TIANGEN; 1: Maint darn 1090 bp, cynnwys GC 68.1%; 2: Maint darn 1915 bp, cynnwys GC 70.4%; 3: Maint darn 448 bp, cynnwys GC 74.8%; 4: Maint darn 1527 bp, cynnwys GC 61.5%. Canlyniadau arbrofol: Gall Kit PCR Blood Direct chwyddo darnau DNA yn effeithiol gyda'r cynnwys GC ar yr ystod o 61.5% -74.8%, gan awgrymu ei fod yn gallu ymhelaethu ar ddarnau GC uchel.
	Gan ddefnyddio gwrthgeulyddiad EDTA dynol fel templed, cafodd 5 genyn â gwahanol hyd (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 a Hn4.0) eu chwyddo gan Blood Direct PCR Kit. Roedd y system adweithio PCR yn 20 μl, a defnyddiwyd gwaed 1 μl fel templed. M: Marciwr II TIANGEN; 1-3: 3 sampl gwaed wahanol; NTC: rheolaeth heb primers. Canlyniadau arbrofol: Gall Kit PCR Blood Direct chwyddo darnau gyda'r hyd cyhyd â 4 kb, gan awgrymu ei fod yn gallu ymhelaethu ar ddarnau hir.
	Gan ddefnyddio gwrthgeulydd EDTA dynol fel templed, defnyddiwyd Kit Direct Blood Direct ar gyfer canfod PCR o wahanol samplau gwaed. Roedd y system adweithio PCR yn 20 μl, a defnyddiwyd gwaed 1 μl fel templed. M: Marciwr II TIANGEN; 1-9: swm llwytho'r gwaed yw 0.1 μl, 0.2 μl, 0.3 μl, 0.4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl a 5 μl, yn y drefn honno; NTC: rheolaeth heb dempled Canlyniadau arbrofol: Mae gan Kit PCR Blood Direct wrthwynebiad cryf i waed a gall ymhelaethu samplau gwaed gyda'r ystod llwytho o 0.1-5 μl.
	Defnyddiwyd samplau gwaed o rywogaethau dynol, llygod mawr, cyw iâr a rhywogaethau eraill â thriniaethau gwahanol fel templedi. Defnyddiwyd Kit PCR Blood Direct i ymhelaethu ar PRNP (dynol, 750 bp), Actin (llygoden fawr, 200 bp), a β-Actin (Cyw Iâr, 1.0 kb). Roedd y system adweithio PCR yn 20 μl, a defnyddiwyd gwaed 1 μl fel templed. M: Marciwr TIANGEN II. Canlyniadau arbrofol: Gellir cymhwyso Cit PCR Gwaed Uniongyrchol ar ystod eang o samplau, a gellir canfod y PCR yn uniongyrchol ar samplau gwaed o wahanol rywogaethau â thriniaethau gwahanol.

C: Dim bandiau ymhelaethu

Templed A-1

■ Mae'r templed yn cynnwys amhureddau protein neu atalyddion Taq, ac ati. ——Creu templed DNA, cael gwared ar amhureddau protein neu dynnu DNA templed gyda chitiau puro.

■ Nid yw dadnatureiddio templed yn gyflawn —— Cynyddu tymheredd dadnatureiddio yn briodol ac ymestyn amser dadnatureiddio.

Diraddio templed —— Ail-baratoi'r templed.

Primer A-2

■ Ansawdd gwael primers —— Ail-syntheseiddio'r primer.

■ Diraddio primer ——Gwelwch y preimio crynodiad uchel yn gyfaint fach i'w cadw. Osgoi rhewi a dadmer lluosog neu cryopreserved tymor hir 4 ° C.

■ Dyluniad primer primers (ee hyd primer ddim yn ddigonol, dimer wedi'i ffurfio rhwng primers, ac ati) - Ailgynllunio primers (osgoi ffurfio dimer primer a strwythur eilaidd)

A-3 Mg²⁺crynodiad

■ Mg²⁺ mae'r crynodiad yn rhy isel —— Cynyddu Mg yn briodol²⁺crynodiad: Optimeiddio'r Mg²⁺ crynodiad gan gyfres o adweithiau o 1 mM i 3 mM gydag egwyl o 0.5 mM i bennu'r Mg gorau posibl²⁺ crynodiad ar gyfer pob templed a primer.

A-4 Tymheredd Annealing

■ Mae'r tymheredd anelio uchel yn effeithio ar rwymo primer a thempled. ——Gwelwch y tymheredd anelio a gwneud y gorau o'r cyflwr gyda graddiant o 2 ° C.

A-5 Amser estyn

■ Amser estyn byr —— Cynyddu'r amser estyn.

C: Anwir positif

Ffenomena: Mae samplau negyddol hefyd yn dangos y bandiau dilyniant targed.

A-1 Halogiad PCR

■ Traws-halogi dilyniant targed neu gynhyrchion ymhelaethu —— Yn anffodus i beidio â phibetio'r sampl sy'n cynnwys dilyniant targed yn y sampl negyddol na'u gollwng allan o'r tiwb centrifuge. Dylai'r adweithyddion neu'r offer gael eu hawtoclafio i gael gwared ar asidau niwcleig sy'n bodoli, a dylid pennu bodolaeth halogiad trwy arbrofion rheoli negyddol.

Halogiad ymweithredydd ——Gwelwch yr adweithyddion a'u storio ar dymheredd isel.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ mae'r crynodiad yn rhy isel —— Cynyddu Mg yn briodol²⁺ crynodiad: Optimeiddio'r Mg²⁺ crynodiad gan gyfres o adweithiau o 1 mM i 3 mM gydag egwyl o 0.5 mM i bennu'r Mg gorau posibl²⁺ crynodiad ar gyfer pob templed a primer.

■ Dyluniad primer amhriodol, ac mae gan y dilyniant targed homoleg gyda'r dilyniant nad yw'n darged. —— Ail-ddylunio primers.

C: Ymhelaethiad amhenodol

Ffenomena: Mae'r bandiau ymhelaethu PCR yn anghyson â'r maint disgwyliedig, naill ai'n fawr neu'n fach, neu weithiau mae bandiau ymhelaethu penodol a bandiau ymhelaethu amhenodol yn digwydd.

Primer A-1

■ Penodoldeb primer gwael

—— Ail-ddylunio primer.

■ Mae'r crynodiad primer yn rhy uchel —— Cynyddu'r tymheredd dadnatureiddio yn raddol ac ymestyn amser dadnatureiddio.

A-2 Mg²⁺ crynodiad

■ Yr Mg²⁺ mae'r crynodiad yn rhy uchel —— Lleihau'r crynodiad Mg2 + yn briodol: Optimeiddio'r Mg²⁺ crynodiad gan gyfres o adweithiau o 1 mM i 3 mM gydag egwyl o 0.5 mM i bennu'r Mg gorau posibl²⁺ crynodiad ar gyfer pob templed a primer.

A-3 Polymeras thermostadwy

■ Swm ensym gormodol ——Gwelwch swm ensym yn briodol ar gyfnodau o 0.5 U.

A-4 Tymheredd Annealing

■ Mae'r tymheredd anelio yn rhy isel —— Cynyddu'r tymheredd anelio yn briodol neu fabwysiadu'r dull anelio dau gam

Cylchoedd PCR A-5

■ Gormod o gylchoedd PCR —— Lleihau nifer y cylchoedd PCR.

C: Bandiau patsh neu ceg y groth

Primer A-1—— Penodoldeb penodol —— Ail-ddylunio'r primer, newid lleoliad a hyd y paent preimio i wella ei benodolrwydd; neu berfformio PCR nythu.

Templed A-2 DNA

—— Nid yw'r templed yn bur ——Diogelu'r templed neu dynnu DNA gyda chitiau puro.

A-3 Mg²⁺ crynodiad

——Mg²⁺ mae'r crynodiad yn rhy uchel —— Lleihau Mg yn briodol²⁺ crynodiad: Optimeiddio'r Mg²⁺ crynodiad gan gyfres o adweithiau o 1 mM i 3 mM gydag egwyl o 0.5 mM i bennu'r Mg gorau posibl²⁺ crynodiad ar gyfer pob templed a primer.

A-4 dNTP

——Mae crynodiad dNTPs yn rhy uchel ——Gwella crynodiad dNTP yn briodol

A-5 Tymheredd Annealing

——To tymheredd anelio isel —— Cynyddu'r tymheredd anelio yn briodol

Beiciau A-6

——Do lawer o feiciau ——Gwella rhif y beic

C: Faint o DNA templed y dylid ei ychwanegu mewn system adweithio PCR 50 μl?

C: Sut i ymhelaethu ar ddarnau hir?

Y cam cyntaf yw dewis y polymeras priodol. Ni all polymeras Taq rheolaidd brawfddarllen oherwydd diffyg gweithgaredd datgladdu 3'-5 ', a bydd camgymhariad yn lleihau effeithlonrwydd estyn darnau yn fawr. Felly, ni all polymeras Taq rheolaidd ymhelaethu ar ddarnau targed sy'n fwy na 5 kb yn effeithiol. Dylid dewis Taq polymerase gydag addasiad arbennig neu polymeras ffyddlondeb uchel arall i wella effeithlonrwydd estyniad a diwallu anghenion ymhelaethu darn hir. Yn ogystal, mae ymhelaethu ar ddarnau hir hefyd yn gofyn am addasiad cyfatebol o ddyluniad primer, amser dadnatureiddio, amser estyn, pH byffer, ac ati. Fel arfer, gall preimio â 18-24 bp arwain at well cynnyrch. Er mwyn atal difrod templed, dylid lleihau'r amser dadnatureiddio ar 94 ° C i 30 eiliad neu lai y cylch, a dylai'r amser i godi tymheredd i 94 ° C cyn ymhelaethu fod yn llai nag 1 munud. Ar ben hynny, gall gosod tymheredd yr estyniad ar oddeutu 68 ° C a dylunio'r amser estyn yn ôl y gyfradd o 1 kb / min sicrhau ymhelaethiad effeithiol ar ddarnau hir.

C: Sut i wella ffyddlondeb ymhelaethu PCR?

Gellir lleihau cyfradd gwallau ymhelaethu PCR trwy ddefnyddio amryw o bolymerasau DNA gyda ffyddlondeb uchel. Ymhlith yr holl bolymerasau DNA Taq a ddarganfuwyd hyd yn hyn, ensym Pfu sydd â'r gyfradd wallau isaf a'r ffyddlondeb uchaf (gweler y tabl ynghlwm). Yn ogystal â dewis ensymau, gall ymchwilwyr leihau cyfradd treiglo PCR ymhellach trwy optimeiddio amodau adweithio, gan gynnwys optimeiddio cyfansoddiad byffer, crynodiad polymeras thermostable a gwneud y gorau o rif beic PCR.

Ysgrifennwch eich neges yma a'i hanfon atom